Microscope confocal FLIM/Hyperspectral pour imagerie ultra-rapide de cellules vivantes

Client : Sunnybrook Research Institute
Secteurs d'activité : Sciences de la vie, Médical
Technologies : Microscopie par fluorescence, Imagerie hyperspectrale

Contexte

L'INO offre des services intégrés de haute technologie pour la conception et la construction de microscopes multi-modaux personnalisés et uniques. Voici un exemple de réalisation : un système FLIM-FRET / hyperspectral ultrarapide pour étudier les interactions protéine-protéine de cellules vivantes complexes et les phénomènes biochimiques dans le développement de médicaments.

Une imagerie toujours plus rapide de cellules vivantes et d’interactions biomoléculaires est nécessaire pour les applications en sciences de la vie de haute performance, telle que le développement de médicaments. Le criblage cellulaire à débit élevé (high content screening, ou HCS) est une technique fréquemment utilisée dans ce domaine de recherche. La combinaison de la microscopie de temps de vie de fluorescence (FLIM) et de l’imagerie hyperspectrale pour le criblage de médicaments peut fournir des informations sur la spécificité moléculaire, de même que sur le mécanisme d’action des molécules ciblées.

Solution

L’INO a développé un système FLIM-FRET / hyperspectral ultrarapide pour étudier les interactions protéine-protéine de cellules vivantes complexes et les phénomènes biochimiques dans le développement de médicaments. L’objectif est de réduire drastiquement le temps de découverte de nouveaux médicaments en utilisant un microscope multimode automatisé et construit sur mesure, combinant des images FLIM et hyperspectral avec une résolution à la limite de la diffraction.

 

Flim Hs Ino

Le système possède une plus grande rapidité de détection que les systèmes conventionnels, permettant un criblage FLIM. Son design optomécanique robuste permet de résister aux désalignements ou autres mouvements dus à des changements thermiques ou des vibrations, garantissant une qualité d’imagerie à long terme. Le logiciel sélectionne automatiquement les zones d’intérêt grâce à un plug-in qui permet de modifier les paramètres de sélection et le type de zones d’intérêt à observer. La possibilité de choisir l’algorithme approprié offre à l’utilisateur des données spécifiques selon le besoin de chaque expérience.

Caractéristiques clés :

  • Permet l’acquisition de 20 images, 400x400 pixels, par puits, sur une plaque de 384 puits en moins de 24 heures.
  • Une vitesse de comptage allant jusqu’à 16 Mcts/sec permet des acquisitions de 400x400 pixels en moins de 10 secondes dépendamment de l’échantillon.
  • Les images FLIM et hyperspectrales sont acquises simultanément grâce à l’intercalage de l’excitation.
  • Plusieurs modes de criblage automatique et algorithmes de régression peuvent être développés (plugin .dll) pour les différents besoins expérimentaux.

Les résultats préliminaires suivant démontrent l’utilisation du système pour détecter la disruption d’une interaction connue lors de l’ajout d’un médicament.

Logiciel d’acquisition et d’analyse

  • Sélection automatique du ROI (possibilité d’utiliser un .dll custom) pour cribler uniquement les photons pertinents pour l’analyse FLIM ou hyperspectrale
  • Puissant algorithme de régression (MLE), pouvant être adapté au besoin  (possibilité d’utiliser un plugin .dll sur mesure)
  • Capacités de HCS interfacées avec le logiciel d’imagerie Nikon
  • Analyse par lots

FLIM FRET Software Screenshot 1.1

Fenêtre d'acquisition et de configuration : le logiciel permet à l'utilisateur de sélectionner les paramètres d'acquisition requis en fonction du besoin particulier requis par l'expérience menée. Une interface intuitive permet de visualiser la sélection des filtres, ainsi que des fluorophores favoris.

Soft 2 Flimfret

Fenêtre de visualisation et d'analyse : Ici, des cellules BMK-d3 exprimant mCerulean-BCL-XL et Venus BAD enregistrées par le système. Le logiciel sélectionne automatiquement les zones d'intérêts, montrées en couleurs dans l'image TCSPC et en gris dans l'image hyperspectrale.

Soft 3 Flimfret

Fenêtre des zones d'intérêts (ROI) : Pour chaque zone d'intérêt sélectionnée, l'utilisateur peut visualiser le temps de vie adéquat, ainsi que la valeur et le spectre associés.

Résultats préliminaires : BCL-XL délie BAD par le médicament ABT263

Ces résultats ont été obtenus par le groupe de recherche du Dr. David Andrews, Sunnybrook Research Institute.

FLIM FRET Results Screenshot 1

Des cellules de reins provenant de bébés souris (BMK)-d3 exprimant de manière stable mCerulean3, le fluorophore donneur, fusionnées à la protéine BCL-XL : « mCerulean3-BCL-XL », ont été transfectées de manière transitoire avec le fluorophore accepteur (Venus), fusionné à la protéine BAD : «Venus-Bad».  Venus-Bad se lie de manière spontanée à mCerulean3-BCL-XL, causant du FRET de proximité entre les fluorophores donneur et accepteur, constituant le contrôle positif de liaisons. Lorsque la transfection s’effectue avec un mutant de la protéine Bad (Venus-BAD2A) qui ne se lie pas avec mCerulean3-BCL-XL, aucun FRET n’est possible, résultant au contrôle négatif de l’expérimentation. 

Results 2 Flimfret

Lorsque la drogue ABT-263 est ajouté 5 heures après transfection, les résultats préliminaires indiquent que ABT-263 peut interférer avec l’interaction entre BCL-XL et BAD, démontré par la perte de FRET entre les deux fluorophores, comme démontré précédemment par Liu et al., 2012.

 

Nous remercions CQDM, CFI et le programme BL-NCE pour le financement de ce travail. Ce projet a été rendu possible avec la collaboration des groupes de recherche du Dr. David Andrews (Sunnybrook Research Institute) et du Prof. Qiyin Fang (McMaster University).

 

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